NUMERO VARIABLE DE REPETICIONES EN TANDEM (VNTR) Y SU APLICACIÓN EN LA GENETICA MOLECULAR Y EPIDEMIOLOGIA

Los VNTR, por sus siglas en inglés de Variable Number of Tandem Repeats, más conocidas como minisatélites, que son repeticiones de secuencias de entre 6-25 nucleótidos que incluyen miles de pares de bases, que se utilizan como marcadores moleculares. El número de repeticiones de estas secuencias, como bien indica su nombre, es variable. Muchos de estos loci muestran hipervariabilidad en sus números de repetición en humanos y en animales y, por lo tanto, también se denominan loci de repetición en tándem de número variable (VNTR) y estos son una herramienta para la genotipificación y proporciona datos en un formato simple y no ambiguo basado en el número de secuencias repetitivas. Sin embargo, muchos aspectos de los mecanismos de la variabilidad, sus roles biológicos y su participación en los procesos evolutivos siguen siendo misteriosos (Mazars et al .,2001; Supply et al.., 2000). 

Los perfiles genéticos completos de dos individuos que no sean gemelos idénticos revelarían muchas diferencias, pero dado que la mayoría de los genes humanos son iguales de persona a persona, la tipificación del ADN se basa en los segmentos de ADN que tienden a diferir entre diferentes personas, mientras que las secuencias repetidas en sí mismas suelen ser las mismas de una persona a otra. El número de veces que se repiten tiende a variar, estos tramos de repeticiones conocidos como Número Variable de Repeticiones en Tándem o los VNTR se pueden aislar del ADN de un individuo el número de repeticiones y se puede medir dividiendo el peso molecular total de un VNTR dado por el peso molecular de la secuencia repetida, los VNTR son similares a las repeticiones cortas en tándem, la diferencia es que en un VNTR, la secuencia repetida tiene una longitud de entre diez y cien pares de bases.

TITULO EN YOUTUBE: VNTR - Variable Number of Tandem Repeats (Better Explained)

En el esquema de abajo tenemos representado gráficamente y de forma muy básica cómo podemos diferenciar los individuos mediante VNTRs o minisatélites (también sería un ejemplo válido para los RFLPs). En la imagen se puede observa cuatro cromosomas (rojo, amarillo, verde y cian) de tres individuos distintos (individuos A, B y C). Los recuadros azules representan la secuencia, por ejemplo, -CAGGTGGCCTAAATGCGC-, repetida varias veces. Vemos que estas secuencias están repartidas por los diferentes cromosomas del genoma pero se repite un número diferente de veces tanto entre los distintos cromosomas de un individuo como entre los distintos individuos. Algunas de las repeticiones pueden coincidir entre diferentes individuos, lo que nos daría una relación de parentesco entre ellos.

La naturaleza de repetición en tándem de los minisatélites se ha estudiado ampliamente en genomas eucariotas. La primera especie bacteriana en la que se identificaron fue Mycobacterium tuberculosis, que se describe como unidades de repetición intercaladas de micobacterias (MIRU). Estos loci tienen una estructura característica que consiste en un número variable de secuencias de ADN repetidas casi idénticas dispuestas consecutivamente. Un término general para estas repeticiones es Repeticiones en tándem de número variable (VNTR) y ahora se han informado VNTR verdaderos en Bacillus anthracis, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica y Escherichia coli O157 .

Aplicación de VNTR en paratuberculosis:

La paratuberculosis, también llamada enfermedad de Johne en rumiantes, se caracteriza por una inflamación crónica del íleon y está causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. En los seres humanos, los síntomas de la enfermedad de Crohn se parecen en parte a los de la enfermedad de Johne en los rumiantes. Debido a la alta prevalencia de estas bacterias en (productos de) rumiantes y su notable termoestabilidad, ha surgido preocupación sobre el posible papel de estas bacterias en la patogénesis de la enfermedad de Crohn. En un intento de desarrollar un método de tipificación molecular para facilitar la toma de huellas dactilares de ADN comparativa significativa de M. avium subsp. paratuberculosis de los reservorios humanos y animales, se exploró el análisis multilocus de repetición en tándem de número variable (MLVA) y se comparó con la tipificación del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) IS900. La tipificación de MLVA subdividió el tipo de RFLP más predominante, R01, en seis subtipos y, por lo tanto, proporciona un enfoque de subtipificación molecular prometedor para estudiar la diversidad de M. avium subsp. Paratuberculosis (Overduin et al ., 2004).

Aplicación de VNTR en Haemophilus influenza tipo b

Haemophilus influenza es una bacteria Gram-negativa. La infección grave suele ser causada por cepas que llevan una cápsula de polisacárido. De los seis tipos capsulares, el tipo b (Hib) causa casi todas las infecciones sistémicas, incluidas; meningitis epiglotitis, osteomielitis, artritis séptica y septicemia. Hasta el 15% de los niños de poblaciones no inmunizadas pueden albergar Hib en la nasofaringe. Se estima que H. influenza tipo b (Hib) causa al menos 3 millones de casos de enfermedades graves y entre 400 000 y 700 000 muertes cada año en niños pequeños (Sheff, 2006; Sinsalo et al.., 2002). La amplificación mediada por PCR del número variable de regiones de repetición en tándem (VNTR) se ha utilizado para detectar la cepa epidémica. Los resultados muestran que los VNTR que comprenden unidades repetidas que tienen una longitud de 3,5 o 6 nucleótidos proporcionaron marcadores genéticos estables que se pueden usar para la tipificación molecular de H. influenza tipo b. Sin embargo, los VNTR construidos a partir de unidades de tetranucleótidos parecen ser muy variables y no adecuados para estudios epidemiológicos (van Belkum et al ., 1997).

Aplicación de análisis de múltiples locus VNTR (MLVA) en Salmonella enterica subsp. enterica

Se ha utilizado el análisis de Multiplelocus VNTR (MLVA) basado en 10 VNTR para genotipar Salmonella enterica subsp. cepas enterica. El análisis de conglomerados no solo identificó tres grupos genéticamente distintos consistentes con la actual clasificación de serovariedades de salmonelas (serovares Typhi , Paratyphi A y Typhimurium), sino que también discriminó 25 subtipos dentro de los aislados de serovar Typhi. Por lo tanto, MLVA tiene potencial para usarse en investigaciones de brotes de fiebre tifoidea (Ramisse et al ., 2004).

Aplicación de VNTR en Bacillus anthracis

Bacillus representa un género de bacterias Gram-positivas que son ubicuas en la naturaleza (suelo, agua y polvo en el aire). B. anthracis es la bacteria que causa el ántrax en vacas, ovejas y, a veces, en humanos. El carbunco se transmite a los humanos a través del contacto directo con productos animales o la inhalación de endosporas. Bajo el microscopio, las células de B. anthracis parecen tener extremos cuadrados y parecen estar unidas por una articulación a otras células. Las esporas se observan mejor cuando la bacteria se cultiva en medios artificiales. Bacillus Anthracises uno de los patógenos más genéticamente homogéneos descritos, lo que dificulta la discriminación de cepas. El análisis VNTR de múltiples locus (MLVA) utiliza el poder combinado de múltiples alelos en varios loci marcadores. Recientemente, se utilizan cebadores de PCR marcados con fluorescencia para producir productos de amplificación de PCR a partir de ocho regiones VNTR en el genoma de B. anthracis. Estos se detectan y sus tamaños se determinan utilizando un secuenciador de ADN automatizado ABI377. Cinco de estos ocho loci se descubrieron mediante la caracterización de la secuencia de marcadores moleculares (vrrC 1, vrrC 2, vrrB 1, vrrB 2 y CG3), dos se descubrieron mediante la búsqueda de secuencias de nucleótidos plásmidos completos (pXO1-aat y pXO2-at) y uno fue conocido previamentevrrA) (Keim et al ., 2000). Bacillus anthracis contiene 30 estructuras comparables en las que la unidad se repite al menos 10 veces. La mitad de estos tándems que se repiten muestran polimorfismo entre las cepas probadas (Le Fleche et al ., 2001).

Aplicación de VNTR en Yersinis pestis

La bacteria gramnegativa Yersinia pestis es el agente causante de la enfermedad infecciosa invasiva sistémica denominada clásicamente plaga y ha sido responsable de tres pandemias humanas: la plaga de Justiniano (siglos VI al VIII), la Muerte por peste negra (siglos XIV al XIX) y peste moderna (siglo XIX hasta la actualidad). La reciente identificación de cepas resistentes a múltiples medicamentos y el uso potencial de Y. pestis como agente de guerra biológica significa que la peste todavía representa una amenaza para la salud humana. Yersinia pestis contiene 64 minisatélites de este tipo en los que la unidad se repite al menos 7 veces. También se evaluó una colección adicional de 12 loci con al menos 6 unidades y una alta conservación interna. Cuarenta y nueve son polimórficas entre cinco cepas de Yersinia (veinticinco entre tres cepas de Y. pestis). El análisis de las secuencias del genoma bacteriano actualmente disponibles clasifica a Yersinia pestis por tener una densidad media de matrices repetidas en tándem de más de 100pb en comparación con los otros genomas bacterianos analizados hasta la fecha. En estos casos, probar una fracción de estas secuencias en busca de polimorfismo fue suficiente para desarrollar rápidamente un conjunto de más de quince marcadores informativos, algunos de los cuales muestran un grado muy alto de polimorfismo (Le Fleche et al.., 2001).

Aplicación de VNTR en E. coli O157: H7

Escherichia coli O157: H7 es una de las principales causas de enfermedades transmitidas por los alimentos. La detección de brotes implica métodos epidemiológicos tradicionales y subtipificación molecular de rutina mediante electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). El PFGE requiere mucha mano de obra y los resultados son difíciles de analizar y no se pueden transferir fácilmente entre laboratorios. El análisis multilocus de repetición en tándem de número variable (VNTR) (MLVA) es un método rápido y portátil que analiza múltiples loci VNTR, que son áreas del genoma bacteriano que evolucionan rápidamente (Noller et al., 2003).

Aplicación de VNTR en L. pneumophila

Legionella pneumophila es el agente de la enfermedad del legionario y la fiebre de Pontiac. Esta bacteria está presente en ambientes acuáticos, donde se replica en hospedadores protozoarios. Las bacterias infectan los macrófagos alveolares tras la inhalación de aerosoles contaminados. El organismo es responsable de una gran cantidad de casos de neumonía nosocomial en pacientes inmunodeprimidos. La familia Legionellaceae contiene más de 40 especies que han sido aisladas de fuentes clínicas o ambientales. Se han descrito tres subespecies de la especie L. pneumophila como las más frecuentemente asociadas con la enfermedad: L. pneumophila subsp. pneumophila, L. pneumophila subsp. fraseri y L. pneumophila subsp. pascullei. Se han desarrollado diferentes técnicas moleculares para caracterizar y analizar las diferentes cepas. El análisis de macrorrestricción y los métodos basados ​​en PCR, como el análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y la PCR cebada arbitrariamente, se han utilizado para genotipar aislados de L. pneumophila. La tipificación VNTR es tan informativa como la electroforesis en gel de campo pulsado para la comparación de cepas. Este método permitió la identificación rápida de las colonias de L. pneumophila y dio un primer indicio de la presencia de varias cepas en una sola muestra (Pourcel et al ., 2003).

CONCLUSIÓNES SOBRE LAS APLICACIONES DE VNTRs

Entre las ventajas de la técnica de VNTRs encontramos que son marcadores que permiten la visualización simultánea de diversas regiones del genoma, dónde se hayan estas secuencias. Su gran limitación, al igual que ocurre con los RFLPs, es que es una técnica lenta, engorrosa y se requieren cantidades considerables de muestra para obtener resultados fiables. Varios métodos de epidemiología molecular indicaron que la estructura de la población de las especies bacterianas parece ser estrictamente, o al menos predominantemente, clonal que se diseminó local o globalmente. La epidemiología molecular es un enfoque poderoso para monitorear las enfermedades infecciosas.

Todos los métodos mencionados tienen algunas desventajas que dificultan la evaluación correcta de las enfermedades infecciosas. En este artículo se ha mencionado el aspecto general de VNTR como un nuevo enfoque en métodos moleculares. Por lo tanto, se requiere más investigación para desarrollar herramientas moleculares robustas, rápidas, baratas y más valiosas para la investigación epidemiológica.

La diferencia básica y principal entre la técnica de RFLPs y VNTRs la encontramos en el tipo de sonda que se usa para cada una de ellas. En la detección de VNTRs las sondas están constituidas por secuencias homólogas a las secuencias repetidas de estos VNTRs o minisatélites, por lo tanto todos los loci hipervariables del genoma se detectan simultáneamente. Por el contrario, en los RFLPs, las sondas son homólogas a secuencias únicas del genoma, por lo que se detecta un locus o pocos loci cada vez.

También podemos analizar los VNTRs mediante PCR. Mediante esta técnica se amplifican los segmentos del genoma que contienen variaciones en el número de repeticiones utilizando primers o iniciadores que flanqueen las secuencias de los VNTRs. Una vez amplificado el DNA, se separan los fragmentos por electroforesis y se tiñen con una sustancia química, generalmente bromuro de etidio, o técnicas análogas. Actualmente, es más frecuente analizar los VNTRs mediante PCR que por hibridación, gracias a los grandes avances en el diseño de los primers.

Revision realizada por Edwin W.

REFERENCIAS BIOBLIOGRAFICAS:

 - https://scialert.net/fulltext/?doi=pjbs.2007.2612.2621

 - https://forensemolecular.es.tl/VNTRs.htm