EXPLICACION PASO A PASO DE LA TECNICA DE ELECTROFORESIS DE ADN EN GEL DE AGAROSA

Electroforesis en gel de agarosa

Introducción

La electroforesis en gel es el procedimiento de laboratorio estándar para separar el ADN por tamaño (p. Ej., Longitud en pares de bases) para visualización y purificación. La electroforesis utiliza un campo eléctrico para mover el ADN cargado negativamente a través de una matriz de gel de agarosa hacia un electrodo positivo. Los fragmentos de ADN más cortos migran a través del gel más rápidamente que los más largos. Por lo tanto, puede determinar la longitud aproximada de un fragmento de ADN ejecutándolo en un gel de agarosa junto a una escalera de ADN (una colección de fragmentos de ADN de longitudes conocidas).

Video de protocolo

Mire el video del protocolo a continuación para aprender cómo realizar la electroforesis en gel:

Equipo

Bandeja de fundición

peines

Fuente de voltaje

Caja de gel

Fuente de luz UV

Microonda

Icono de reactivos

Reactivos

TAE ( receta aquí )

Agarosa

Bromuro de etidio (concentración de stock de 10 mg / ml)

Procedimiento

Verter un gel de agarosa estándar al 1%:

1. Medir 1 g de agarosa. 

* Tip * Los geles de agarosa se usan comúnmente en concentraciones de 0.7% a 2% dependiendo del tamaño de las bandas que se necesitan separar. Simplemente ajuste la masa de agarosa en un volumen dado para hacer geles de otras concentraciones de agarosa (por ejemplo, 2 g de agarosa en 100 ml de TAE formarán un gel al 2%).

2. Mezcle polvo de agarosa con 100 ml de 1xTAE en un matraz apto para microondas.

* Tip * TBE se puede usar en lugar de TAE, los laboratorios generalmente usan uno u otro, pero hay muy poca diferencia entre los dos.

Nota: Asegúrese de usar el mismo tampón que el que está en la caja del gel (no mezcle diferentes tampones y no use agua).

3. Microondas durante 1-3 minutos hasta que la agarosa se disuelva por completo (pero no sobrecargue la solución, ya que parte del tampón se evaporará y, por lo tanto, alterará el porcentaje final de agarosa en el gel. Muchas personas prefieren microondas en pulsos, agitando el matraz ocasionalmente a medida que la solución se calienta).

PRECAUCIÓN: ¡CALIENTE! Tenga cuidado al revolver, puede producirse una ebullición eruptiva.

* Tip * Es una buena idea calentar en el microondas durante 30-45 segundos, detenerse y girar, y luego continuar hasta que hierva. Esté atento a que la solución tiene tendencia a hervir. Colocar una envoltura de sarán sobre la parte superior del matraz puede ayudar con esto, pero no es necesario si prestas mucha atención.

4. Deje que la solución de agarosa se enfríe a aproximadamente 50 ° C (aproximadamente cuando puede mantener cómodamente la mano sobre el matraz), aproximadamente 5 minutos.

5. (Opcional) Agregue bromuro de etidio (EtBr) a una concentración final de aproximadamente 0.2-0.5 μg/mL (generalmente alrededor de 2-3 μl de solución de laboratorio por 100 mL de gel). EtBr se une al ADN y le permite visualizar el ADN bajo luz ultravioleta (UV).

PRECAUCIÓN: EtBr es un mutágeno conocido. Use una bata de laboratorio, protección para los ojos y guantes cuando trabaje con este químico.

Nota: Si agrega EtBr a su gel, también querrá agregarlo al búfer en ejecución cuando ejecute el gel. Si no agrega EtBr al gel y al tampón, deberá remojar el gel en la solución de EtBr y luego enjuagarlo en agua antes de poder formar una imagen del gel.

6. Vierta la agarosa en una bandeja de gel con el peine bien colocado.

* Tip * Vierta lentamente para evitar burbujas que alteren el gel. Cualquier burbuja se puede alejar del peine del pozo o hacia los lados / bordes del gel con una punta de pipeta.

7. Coloque el gel recién vertido a 4°C durante 10-15 minutos O deje reposar a temperatura ambiente durante 20-30 minutos, hasta que se haya solidificado por completo.

* Tip * Si tiene prisa, el gel se fijará más rápidamente si coloca la bandeja de gel a 4 ° C antes, de modo que ya esté fría cuando se vierta el gel en ella.

Carga de muestras y ejecución de un gel de agarosa:

1. Agregue buffer de carga a cada una de sus muestras de ADN.

Nota: La carga del tampón tiene dos propósitos: 1) proporciona un tinte visible que ayuda con la carga del gel y le permite medir qué tan lejos ha migrado el ADN; 2) contiene un alto porcentaje de glicerol que aumenta la densidad de la muestra de ADN y hace que se deposite en el fondo del gel, en lugar de difundirse en el tampón.

2. Una vez solidificado, coloque el gel de agarosa en la caja de gel (unidad de electroforesis).

3. Llene la caja de gel con 1xTAE (o TBE) hasta que el gel esté cubierto.

* Tip * Recuerde, si agregó EtBr a su gel, agregue también algo al búfer. EtBr tiene carga positiva y correrá en la dirección opuesta al ADN. Entonces, si ejecuta el gel sin EtBr en el tampón, alcanzará un punto donde el ADN estará en la parte inferior del gel, pero todo el EtBr estará en la parte superior y sus bandas serán diferencialmente intensas. Si esto sucede, puede remojar el gel en una solución de EtBr y enjuagarlo con agua para nivelar la mancha después de que se haya corrido el gel, tal como lo haría si no hubiera agregado EtBr al gel en primer lugar.

4. Cargue cuidadosamente una escalera de peso molecular en el primer carril del gel.

Nota: Al cargar la muestra en el pozo, mantenga una presión positiva sobre la muestra para evitar que las burbujas o el tampón entren en la punta. Coloque la parte superior de la punta de la pipeta en el tampón justo encima del pozo. Muy lenta y constantemente, empuje la muestra hacia afuera y observe cómo la muestra llena el pozo. Después de descargar toda la muestra, empuje la pipeta hasta el segundo tope y levante con cuidado la pipeta directamente del tampón.

5. Cargue cuidadosamente sus muestras en los pocillos adicionales del gel.

6. Ejecute el gel a 80-150 V hasta que la línea de tinte esté aproximadamente entre el 75 y el 80% del gel. Un tiempo de ejecución típico es de aproximadamente 1-1.5 horas, dependiendo de la concentración y el voltaje del gel.

Nota: el negro es negativo, el rojo es positivo. El ADN tiene carga negativa y correrá hacia el electrodo positivo. Siempre corre a rojo.

7. Apague la alimentación, desconecte los electrodos de la fuente de alimentación y luego retire con cuidado el gel de la caja de gel.

8. (Opcional) Si no agregó EtBr al gel y al tampón, coloque el gel en un recipiente lleno con 100 ml de tampón de ejecución TAE y 5 μL de EtBr, coloque en una mecedora durante 20-30 minutos, reemplace la solución de EtBr con agua y desinfectar durante 5 minutos.

9. Usando cualquier dispositivo que tenga luz UV, visualice sus fragmentos de ADN. Los fragmentos de ADN generalmente se denominan 'bandas' debido a su apariencia en el gel.

* Tip * Si va a purificar el ADN para su uso posterior, use UV de onda larga y exponga durante el menor tiempo posible para minimizar el daño al ADN.

Nota: Cuando use luz UV, proteja su piel usando gafas de seguridad o una careta, guantes y una bata de laboratorio.

Analizando tu gel:

Usando la escalera de ADN en el primer carril como guía (las instrucciones del fabricante le indicarán el tamaño de cada banda), puede inferir el tamaño del ADN en sus carriles de muestra. Para obtener más detalles sobre cómo hacer resúmenes de diagnóstico y cómo interpretarlos, consulte la página Resumen de diagnóstico .

ADN purificador de su gel:

Si está realizando ciertos procedimientos, como la clonación molecular, deberá purificar el ADN del gel de agarosa.

Consejos y preguntas frecuentes

¿Cómo se obtiene una mejor resolución de las bandas?

Algunas formas simples de aumentar la resolución (nitidez) de sus bandas de ADN incluyen: a) ejecutar el gel a un voltaje más bajo durante un período de tiempo más largo; b) usando un peine de gel más ancho / delgado; o c) cargar menos ADN en el pozo. Otro método para visualizar fragmentos de ADN muy cortos es la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), que generalmente se usa para separar fragmentos de 5 a 500 pb.

¿Cómo se consigue una mejor separación de las bandas?

Si tiene bandas de tamaño similar que se ejecutan demasiado juntas, puede ajustar el porcentaje de agarosa del gel para obtener una mejor separación. Un mayor porcentaje de gel de agarosa ayudará a resolver bandas más pequeñas entre sí, y un menor porcentaje de gel ayudará a separar bandas más grandes.

Regla del 10%:

Para cada muestra que desee cargar en un gel, haga un 10% más de volumen del necesario porque se pueden perder varios microlitros al pipetear. Por ejemplo, si desea cargar 1.0 μg en 10 μL, haga 1.1 μg en 11 μL.

Por Edwin W.