REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR): LA INNOVACIÓN QUE REVOLUCIONO LA BIOLOGÍA MOLECULAR

HISTORIA DE LA PCR

Fue inventado por Kary Mullis en 1983, quien luego ganó un premio Nobel de Química por esta técnica innovadora que no solo revolucionó los estudios moleculares sino que los simplificó. La amplificación de dichos segmentos de ADN se produce en un termociclador también conocido como máquina de PCR.

ASPECTOS IMPORTANTES DE LA PCR:

• La Reacción en Cadena de la Polimerasa, o PCR, es una técnica para hacer muchas copias de una determinada región de ADN in vitro (es decir en un tubo de ensayo en lugar en el de un organismo).
• La PCR depende de enzima llamada DNA polimerasa termoestable: la Taq polimerasa, y requiere de cebadores o primers de ADN diseñados específicamente para la región de ADN de interés.
• En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura que permiten la producción de muchas copias de la región blanco.
• La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza de forma rutinaria en la clonación de ADN, el análisis forense de ADN, estudios genómicos, tecnología de ADN recombinante e investigación de diagnóstico molecular. 

QUE ES LA PCR?

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada en biología molecular para hacer (¡millones o miles de millones!) copias de un segmento de ADN específico. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le interese al investigador. Por ejemplo, podría ser un gen cuya función quiere entender un cientifico o un marcador genético usado por científicos forenses para relacionar el ADN de la escena del crimen con los sospechosos.

Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente material de ADN de la región objetivo para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para otros experimentos. La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en biología molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología.

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LA Taq POLIMERASA

Lo mismo que sucede en la replicación de ADN en un organismo, la PCR requiere de una enzima llamada DNA polimerasa que produzca nuevas cadenas de ADN mediante el uso de las cadenas existentes como molde. La ADN polimerasa que normalmente se utiliza en la PCR se llama Taq polimerasa, por la bacteria tolerante al calor de la que se aisló (Thermus aquaticus).

Esta bacteria vive en aguas termales y fuentes hidrotermales. Su ADN polimerasa es muy termoestable y su mayor actividad se presenta cerca de los 70 °\text C70°C70, °, start text, C, end text (temperatura a la que la ADN polimerasa de ser humano o de E. coli no funcionaría). La Taq polimerasa es ideal para la PCR gracias a esta estabilidad térmica. Como veremos en el video animado del canal de Youtube, la PCR utiliza altas temperaturas repetidamente para desnaturalizar el molde de ADN o separar sus cadenas.

CEBADORES Y ESPECIFICIDAD DE PCR

La clave para la especificidad de la PCR son los cebadores o primers. Los cebadores están diseñados para localizar una secuencia de ADN a cada lado del gen objetivo. El cebador es exactamente complementario a una secuencia corta (20-30 bases) de ADN a cada lado del objetivo y, por lo tanto, se unirá solo a esa secuencia. De esta manera, se puede considerar que el cebador encuentra la "aguja en el pajar". Luego, la PCR produce millones o miles de millones de copias de esta secuencia única, produciendo “pajar de agujas”.

Una secuencia corta de cebador será menos específica. La posibilidad de que aparezca una base en cualquier posición del genoma es de una en 4 (4 bases). Por lo tanto, si su cebador tiene solo 2 bases de largo, existe una probabilidad de 1 en 16 de encontrar esa secuencia aleatoria de 2 bases en el genoma. Dado que el genoma tiene aproximadamente 3 mil millones de bases, es probable que encuentre una secuencia de 2 bases muy a menudo, por lo que el cebador no proporcionará especificidad. Un cebador de 20 bases da un 1 en 1,099,511,627,776, eso es un 1 en un billón de posibilidades de encontrar la misma secuencia al azar en el genoma.

LOS PASOS DE LA PCR

Los componentes clave para una reacción de PCR exitosa son Taq polimerasa, cebadores, ADN molde y nucleótidos (los bloques básicos del ADN). Los componentes se colocan en un tubo, junto con los cofactores que necesite la enzima, y se someten a ciclos repetidos de calentamiento y enfriamiento que permiten la síntesis del ADN.

Los pasos básicos son:

Desnaturalización: Este paso es donde la cadena de ADN se desenrolla y se separa calentando a 95°C durante 15 segundos. La reacción se calienta bastante para separar, o desnaturalizar las cadenas de ADN. Esto proporciona los moldes de cadena sencilla para el siguiente paso.

Templado o hibridación de cebadores: Aquí la mezcla de reacción se enfría a 54°C y los cebadores se hibridan con las cadenas de ADN separadas. La reacción se enfría para que los cebadores puedan unirse a sus secuencias complementarias en el molde de ADN de cadena sencilla.

Extensión o alargamiento: a 72 'C, la ADN polimerasa alarga ambos cebadores en la dirección de la secuencia objetivo porque la síntesis de ADN es las direcciones 5' a 3 '. La temperatura de la reacción se eleva para que la Taq polimerasa extienda los cebadores y sintetice así nuevas cadenas de ADN.

Después de aproximadamente 25 A 35 ciclos de los pasos anteriores, se habrán realizado millones de copias del segmento de ADN de interés. Eso es porque no solo se usa el ADN original como molde en cada ciclo. En realidad, el nuevo ADN que se produce en una ronda puede servir como molde en la siguiente ronda de síntesis de ADN. Hay muchas copias de los cebadores y muchas moléculas de Taq polimerasa flotando en la reacción, por lo que el número de moléculas de ADN casi puede duplicarse en cada ciclo. La siguiente imagen muestra este patrón de crecimiento exponencial.

La amplificación de ADN mediante el uso de PCR tiene muchas aplicaciones en la industria de la ciencia aplicada. En el diagnóstico médico, las pruebas basadas en PCR se utilizan para la detección de mutaciones, agentes infecciosos y supresores. También es ampliamente utilizado en medicina forense para pruebas de paternidad y huellas de ADN. 

Por Edwin W.