INTRODUCCION A LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF EN MICROBIOLOGÍA CLINICA
Por Mary Gabriela.
Los métodos fenotípicos para la identificación de bacterias, incluido el grupo Gram, las características de crecimiento en cultivos y las pruebas bioquímicas, siguen siendo las pruebas elegidas para realizar análisis microbiológicos en la mayoría de los laboratorios clínicos en todo el mundo. Si bien estos son métodos tradicionales, brindan respuestas al especialista en salud clínico que a menudo requieren mucho tiempo, llegando a varios días en el caso de microorganismos fastidiosos, de ahí la necesidad de herramientas de diagnóstico más rápidas y precisas. Algunas técnicas moleculares como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), la secuenciación y los microarrays se han implementado con éxito en la identificación, pero aún no se han generalizado debido a algunas limitaciones prácticas.
La adopción de la espectrometría de masas MALDI-TOF (MALDI-TOF MS) por parte de los laboratorios clínicos ha sido fenomenal, numerosos factores han contribuido a su éxito y sentaron las bases para su aceptación universal como plataforma fundamental para el diagnóstico de microbiología. Durante mi estancia en la carrera de Bioquimica, aun se utilizaba el Metodo Kirby-Bauer (método de difusión en agar) para determinar la sensibilidad de un agente microbiano frente a un antibiótico o quimioterápico, pero el tiempo de obtener resultados tardaban de 3 a 7 dias y el tiempo es un factor determinante a la hora de diagnosticar el agente infeccioso en un paciente.
Una década de diseños, nuevos análisis y validaciónes marcó el comienzo de la aceptación gradual de MALDI-TOF en los laboratorios de diagnóstico, pero los principales laboratorios de referencia y de salud pública permanecieron escépticos durante un largo período.
Por lo tanto, esta revision puede servir como referencia para la transformación tecnológica que a menudo requiere de la persistencia de algunos científicos y especialistas afines a la Microbiologia Clinica, Infectologia y Medicina Interna.
La espectrometría de masas es una técnica utilizada para analizar la relación masa-carga de varios compuestos. La espectrometría de masas es un método importante para identificar los átomos o moléculas en una sustancia química compleja. Un espectrómetro de masas funciona convirtiendo los átomos en iones. Luego separa los iones pasándolos primero a través de un campo eléctrico, luego a través de un campo magnético, por lo que los iones se separan en un espectro. Un detector computarizado cuenta los iones en diferentes partes del espectro y usa esta información para determinar qué tipos de átomos estaban en la muestra original. Se han desarrollado diferentes métodos de espectrometría de masas, y el método más utilizado hasta la fecha para el análisis de biomoléculas es la espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desionización asistida por matriz (MALDI-TOF MS), que se desarrolló en la década de 1980.
MALDI-TOF MS se usa comúnmente en el laboratorio para identificar proteínas y ADN, pero los avances recientes en esta tecnología han hecho posible que el laboratorio de microbiología detecte rápidamente los patógenos, lo que lleva a diagnósticos más rápidos y mejores resultados para los pacientes. Las aplicaciones de MALDI-TOF MS en el laboratorio médico reducen el tiempo entre la recolección de muestras y el diagnóstico. Además, el procesamiento previo de los organismos para su análisis por MALDI-TOF MS es técnicamente simple y reproducible. Los métodos convencionales para la identificación de organismos microbiológicos pueden llevar horas o días.
Se ha utilizado una técnica de espectrometría de masas, desorción láser asistida por matriz, tiempo de vuelo de ionización (MALDI-TOF), en el análisis de diferentes biomoléculas durante décadas, y su aplicación en el diagnóstico microbiológico de rutina es prometedora. Después de su perfeccionamiento en los últimos años, esta técnica ha sido descrita como una herramienta eficaz en la identificación de gramnegativos, enterobacterias, no fermentativos, anaerobios, micobacterias y hongos. El método se basa en el análisis de proteínas y la comparación con los perfiles disponibles almacenados en una base de datos.
LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF
La principal ventaja de esta técnica respecto a otro tipo de espectrometría de masas es, el análisis de macromoléculas con una fragmentación mínima. Esta característica la convierte en una técnica muy versátil en el laboratorio de Microbiología.
La aplicación más utilizada y validada de la espectrometría de masas MALDI-TOF es la identificación de microorganismos. En este caso, el rango de masas de interés está entre los 2.000 Da y los 20.000 Da. La mayoría de los picos de masas que se obtienen en este rango representan proteínas ribosómicas. El conjunto de estos picos de masas constituye el espectro del microorganismo y éste se va a considerar una huella peptídica. Este concepto hace alusión a la singularidad del espectro generado para cada especie microbiana.
El perfil proteico generado se compara finalmente con los perfiles proteicos almacenados para cada microorganismo en la base de datos del equipo que se esté utilizando, de forma que se pueda emitir un informe de identificación en unos pocos segundos. Los algoritmos utilizados para comparar los espectros y asignar un resultado de identificación pueden variar en función del fabricante. El uso cada vez más extendido de bases de datos validadas, comerciales y cada vez más extensas en entradas de microorganismos permite la aplicación de esta tecnología en la rutina diaria de los laboratorios de Microbiología Clínica. Las ventajas universales de la espectrometría de masas MALDI-TOF son el alto rendimiento, el bajo coste en reactivos, la aplicación en muestras sólidas y la facilidad de uso. En el caso de la identificación tiene especial relevancia la rapidez en la emisión de resultados, la posibilidad de partir de una porción minúscula de colonia y la identificación de microorganismos difíciles de identificar por métodos convencionales. La principal desventaja es el alto coste del equipo, la imposibilidad de identificar microorganismos muy relacionados entre sí, o microorganismos que no estén presentes en la base de datos. Con el tiempo, estas limitaciones seguramente serán menores, ya que el precio de las tecnologías suele descender con el tiempo y las bases de datos pueden ir ampliándose, tanto las comerciales y propias del equipo, como las mismas entradas que pueden ir incorporando los usuarios al equipo.
En futuras publicaciones, explicaremos los siguientes temas sobre MALDI-TOF MS:
1. Espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) para el laboratorio clínico
2. Análisis de anaerobios y algunas otras bacterias fastidiosas utilizando MALDI-TOF MS
3. Pruebas de identificación, tipificación y susceptibilidad de hongos (incluidas las levaduras) por MALDI-TOF MS
4. Tipificación molecular de bacterias/hongos utilizando MALDI-TOF MS
5. MALDI-TOF MS para la determinación de la resistencia a los antibióticos
6. Aplicación de MALDI-TOF MS en Microbiología Veterinaria y Alimentaria
7. MALDI-TOF MS para análisis ambiental, investigación de microbiomas y como herramienta para centros de recursos biológicos
8. El mundo de la espectrometría de masas basada en ácido nucleico para la detección microbiana y viral
9. Tendencias y perspectivas futuras de la EM MALDI-TOF en el Laboratorio de Microbiología
Por Mary Gabriela.
Medicina Interna - Infectologa
Hasta la Próxima
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